Tóm tắt
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm diệt khuẩn dùng trong y tế và gia đình. Để các sản phẩm này được phép lưu hành cần phải được khảo nghiệm đánh giá tác dụng diệt khuẩn và độ an toàn. Viện nghiên cứu và phát triển sản phẩm thiên nhiên (IRDOP) đã xây dựng và hoàn thiện quy trình khảo nghiệm chế phẩm diệt khuẩn dựa trên hướng dẫn trong hệ thống tiêu chuẩn châu âu (EN). Quy trình khảo nghiệm dựa trên đánh giá số lượng vi sinh vật còn sống sau khi tiếp xúc với dung dịch chế phẩm diệt khuẩn ở nồng động khác nhau. Hơn hợp sau khi xử lý được khử hoạt chất diệt khuẩn bằng dung dịch chất trung hòa và được tiến hành nuôi cấy trong môi trường thích hợp để các vi sinh vật còn xót lại sau khi bị xử lý bởi chế phẩm diệt khuẩn có thể phát triển được. Sự giảm số vi sinh vật sau quá trình xử lý thể hiện hoạt tính diệt khuẩn của chế phẩm.
1. Nguyên tắc của phương pháp
Mỗi mẫu chế phẩm khi thực hiện khảo nghiệm được đánh giá ở nồng độ thử nghiệm cao nhất theo yêu cầu của chế phẩm hoặc chế phẩm được pha loãng với nước/nước cứng để đạt nồng độ thử nghiệm (các chế phẩm sử dụng với nước).
Các chủng thử nghiệm: Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Escherichia coli, Candida albicans, Bacillus subtilis, salmonella, Mycotuberculosis được chuẩn bị trong dung dịch có các chất tải (bovine albumin 0,3 g/l). Hỗn dịch vi khuẩn thử nghiệm trộn đều trong dung dịch chế phẩm khảo nghiệm với t
hời gian tiếp xúc theo khuyến cáo của nhà sản xuất nhưng không quá 5 phút đến 60 phút ở nhiệt độ 20 ± 10C hoặc theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Đủ thời gian tiếp xúc, một phần dung dịch được lấy ra và làm mất hiệu lực diệt/kìm khuẩn ngay lập tức bằng phương pháp pha loãng- trung hòa. Số lượng vi sinh vật còn sống sót ở mỗi mẫu thử được xác định để tính số lượng giảm của vi khuẩn và đánh giá hiệu lực của chế phẩm khảo nghiệm.
2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
2.1. Thiết bị và dụng cụ
Nồi hấp ướt (Autoclave)
Lò sấy: nhiệt độ từ 1800C đến 2500C
Bể ủ nhiệt hoặc nồi cách thủy đặt nhiệt độ (20±1)0C và (45±1)0C
Tủ ấm (37±1)0C và (30±1)0C
Máy đo pH
Máy lắc voltex
Tủ lạnh
Đồng hồ bấm giờ
Pipet paster 10ml, 5 mL, 1ml, 0,1ml
Đĩa petri thủy tinh hoặc nhựa, đường kính 90mm và 100mm
Hạt thủy tinh kích thước 3mm đến 4mm và 0,3mm đến 0,5mm
Ống nghiệm đường kính 10mm đến 18mm: vô trùng số lượng 150 ống
Que cấy
Bình định mức
2.2. Hóa chất và Môi trường
Nước RO
Môi trường pha loãng (pepton water hoặc trypton water) pH 7,0 (Tryptone sodium chloride)
Môi trường thạch TSA (Tryptone soya agar)
Môi trường thạch SDA ( Sabouraud dextrose Agar)
Ống McFarland 0,5 (tương đương 1,5x108 CFU/1ml) (0,5 mL BaCl2.2H2O 1% + 99,5 mL H2SO4 1%) hoặc máy đo độ đục
Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%
Albumin bò ( Bovine albumin): Dung dịch có sẵn vô trùng 0,3 g/L
Môi trường trung hòa (Na2S2O3 5 g/L, polysorbate 80 30g/L, lecithin 3 g/L)
Môi trường Lowenstein-Jensen (LJ) cho vi khuẩn Lao
3. Các bước tiến hành
3.1. Pha dung dịch chủng thử nghiệm
- Chuẩn bị chủng làm việc theo TCVN 8128-1:2009- Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường cấy trong phòng thử nghiệm và EN 12353: Hóa chất khử trùng và chất sát trùng - Bảo quản chủng vi sinh vật thử để kiểm tra hiệu lực diệt khuẩn (bao gồm cả Legionella), diệt trực khuẩn lao (mycobactericidal), diệt bào tử, diệt nấm và diệt vi rút (bao gồm cả thể thực khuẩn, bacteriophage).
- Dùng que cấy lấy 1 loop chủng từ mẫu chủng chuẩn gốc rồi cấy zic-zac lên đĩa petri chứa môi trường TSA và SDA (Candida albicans), LJ (Mycotuberculosis) sau đó để vào tủ cấy ở 37oC trong vòng 18-24h (7 ngày đối với vi khuẩn lao)
- Các chủng thử nghiệm cấy chuyển 2 lần nếu lưu ở độ âm hoặc dạng đông khô, chủng làm việc là chủng đượcc ấy chuyển lần 3, không sử dụng chủng cấy chuyển lần 4 để làm việc
- Chuẩn bị dung dịch Test suspension (N)
- Trích khuẩn lạc thuần trên đĩa thạch TSA, SDA (Candida albicans), LJ (Mycotuberculosis) đánh tan đều vào ống nghiệm chứa 10 ml dung dịch Tryptone sodium chloride solution dùng máy lắc để trộn đều dung dịch chủng thử nghiệm.
- So độ đục dung dịch đã pha với ống McFarland N để được dung dịch chủng thử nghiệm nồng độ từ 1,5 x 108 CFU/ml (dung dịch N), dung dịch để ở nhiệt độ 20oC trong vòng 2h.
- Để xác định số lượng vi khuẩn có trong dung dịch chủng thử nghiệm thì pha loãng dần bằng dung dịch Tryptone sodium chloride solution để được dung dịch có bậc pha loãng 10-7 và 108. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa thạch TSA, SDA, LJ bằng phương pháp trộn thạch hoặc phương pháp dàn thạch.
a) Phương pháp trộn thạch: hút 1ml dung dịch chủng thử nghiệm vào từng đĩa petri vô trùng (2 đĩa), rót vào mỗi đĩa 15-20ml thạch lỏng vô trùng ở nhiệt độ 45 ± 10C, xoay tròn đều, để đông thạch.
b) Phương pháp dàn thạch: hút 1ml dung dịch chủng thử nghiệm chia đều vào các đĩa thạch đông, mặt khô đã được chuẩn bị trước (ít nhất 2 đĩa), dùng que cấy dàn đều mặt thạch.
Chuẩn bị Validation suspension (NV, NVB)
Pha loãng dung dịch Test suspension (N) với Tryptone sodium chloride solution để đạt nồng độ 3,0 x 103 cfu/ml to 1,6 x 104 cfu/ml ([Khoảng 1/4 (1+3) của nồng độ 10‑5)
Chuẩn bị dung dịch kiểm soát chất trung hòa: Pha loãng dung dịch test suspension về nồng độ 3,0 x 104 cfu/ml to 1,6 x 105 cfu/ml [khoảng 1/4 (1+3) của nồng độ 10‑3)
Đếm khuẩn lạc từ dung dịch Validation suspension và validation của chất trung hòa: Phương pháp đếm tương tự như phương dung dịch test suspension, chuẩn bị dung dịch có bậc pha loãng 10-2
Đọc các đĩa sau mỗi từ 20 – 24h, ủ đến 48h
Bỏ các đĩa không đếm được vì bất cứ lý do gì
Đếm khuẩn lạc và xác định CFU. Số lượng CFU tăng lên sau mỗi thời gian đọc cần lấy số CFU lớn hơn để tính.
Ghi lại các đĩa có số lượng lớn hơn 330 CFU và xác định giá trị Vc
tính số CFU/ml từ các đĩa N, NV, NVB theo công thức
3.2. Chuẩn bị hóa chất, chế phẩm thử nghiệm
- Sản phẩm cần khảo nghiệm, test suspension, validation suspension, dung dịch pha loãng Tryptone sodium chloride solution, chất dẫn, water bath
- Nồng độ của dung dịch thử nghiệm sản phẩm phải gấp 1,25 lần nồng độ thử nghiệm mong muốn (= nồng độ thử nghiệm thực), các chế phẩm sẵn sàng sử dụng có thể thử nghiệm ở 97%
- Chế phẩm thực hiện khảo nghiệm được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất, pha bằng dung dịch nước cứng hoặc nước cất để được dung dịch hóa chất khảo nghiệm ở nồng độ yêu cầu của nhà sản xuất.
- Chế phẩm ở dạng sẵn sàng sử dụng được chuẩn bị nước cất và không khử khoáng có thể dùng nước pha tiêm
- Nếu các chế phẩm ở dạng rắn, sản phẩm được hòa tan ít nhất 1g±10mg sản phẩm với nước cứng tiêu chuẩn trong bình định mức theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Các dung dịch chế phẩm khảo nghiệm phải được chuẩn bị và sử dụng trong vòng 2 giờ, phải đảm bảo dung dịch đồng nhất, ổn định trong suốt quá trình khảo nghiệm, tránh kết tủa, đông vón.
- Trong quá trình thử nghiệm không được chạm vào các miệng ống tube
3.3. Kỹ thuật khảo nghiệm
- Đối với Chủng Pseudomonas aeruginosa; Chủng Staphylococcus aureus; Chủng E. coli ; chủng salmonella: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 13727:2012.
- Chủng Candida albicans: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 13624:2001.
- Chủng Bacillus subtilis: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 14347:2001.
- Chủng Mycotuberculosis: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 14348:2005
Test Na
Cho 0,2 ml dung dịch bovin Albumin đặc gấp 5 lần vào ống nghiệm rồi cho tiếp vào 0,1 ml dung dịch đặc gấp 10 lần dung dịch test suspension chủng thử nghiệm. Bấm đồng hồ ngay lập tức, trộn đều sau đó để vào bể ủ nhiệt ở nhiệt độ (200C) trong thời gian 2 phút ± 10 giây.
Ngay sau khi kết thúc cho 9,7 ml dung dịch sản phẩm bắt bầu bấm giờ nghiệm đặt vào water bath trộng đều với nhiệt độ thử nghiệm và thời gian tiếp xúc. Trước khi kết thúc trộn lại hỗn hợp.