Tóm tắt
Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm diệt khuẩn dùng trong y tế và gia đình. Để các sản phẩm này được phép lưu hành cần phải được khảo nghiệm đánh giá tác dụng diệt khuẩn và độ an toàn. Viện nghiên cứu và phát triển sản phẩm thiên nhiên (IRDOP) đã xây dựng và hoàn thiện quy trình khảo nghiệm chế phẩm diệt khuẩn dựa trên hướng dẫn trong hệ thống tiêu chuẩn châu âu (EN). Quy trình khảo nghiệm dựa trên đánh giá số lượng vi sinh vật còn sống sau khi tiếp xúc với dung dịch chế phẩm diệt khuẩn ở nồng động khác nhau. Hơn hợp sau khi xử lý được khử hoạt chất diệt khuẩn bằng dung dịch chất trung hòa và được tiến hành nuôi cấy trong môi trường thích hợp để các vi sinh vật còn xót lại sau khi bị xử lý bởi chế phẩm diệt khuẩn có thể phát triển được. Sự giảm số vi sinh vật sau quá trình xử lý thể hiện hoạt tính diệt khuẩn của chế phẩm.
1. Nguyên tắc của phương pháp
Mỗi mẫu chế phẩm khi thực hiện khảo nghiệm được đánh giá ở nồng độ thử nghiệm cao nhất theo yêu cầu của chế phẩm hoặc chế phẩm được pha loãng với nước/nước cứng để đạt nồng độ thử nghiệm (các chế phẩm sử dụng với nước).
Các chủng thử nghiệm: Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Escherichia coli, Candida albicans, Bacillus subtilis, salmonella, Mycotuberculosis được chuẩn bị trong dung dịch có các chất tải (bovine albumin 0,3 g/l). Hỗn dịch vi khuẩn thử nghiệm trộn đều trong dung dịch chế phẩm khảo nghiệm với t
hời gian tiếp xúc theo khuyến cáo của nhà sản xuất nhưng không quá 5 phút đến 60 phút ở nhiệt độ 20 ± 10C hoặc theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Đủ thời gian tiếp xúc, một phần dung dịch được lấy ra và làm mất hiệu lực diệt/kìm khuẩn ngay lập tức bằng phương pháp pha loãng- trung hòa. Số lượng vi sinh vật còn sống sót ở mỗi mẫu thử được xác định để tính số lượng giảm của vi khuẩn và đánh giá hiệu lực của chế phẩm khảo nghiệm.
2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
2.1. Thiết bị và dụng cụ
Nồi hấp ướt (Autoclave)
Lò sấy: nhiệt độ từ 1800C đến 2500C
Bể ủ nhiệt hoặc nồi cách thủy đặt nhiệt độ (20±1)0C và (45±1)0C
Tủ ấm (37±1)0C và (30±1)0C
Máy đo pH
Máy lắc voltex
Tủ lạnh
Đồng hồ bấm giờ
Pipet paster 10ml, 5 mL, 1ml, 0,1ml
Đĩa petri thủy tinh hoặc nhựa, đường kính 90mm và 100mm
Hạt thủy tinh kích thước 3mm đến 4mm và 0,3mm đến 0,5mm
Ống nghiệm đường kính 10mm đến 18mm: vô trùng số lượng 150 ống
Que cấy
Bình định mức
2.2. Hóa chất và Môi trường
Nước RO
Môi trường pha loãng (pepton water hoặc trypton water) pH 7,0 (Tryptone sodium chloride)
Môi trường thạch TSA (Tryptone soya agar)
Môi trường thạch SDA ( Sabouraud dextrose Agar)
Ống McFarland 0,5 (tương đương 1,5x108 CFU/1ml) (0,5 mL BaCl2.2H2O 1% + 99,5 mL H2SO4 1%) hoặc máy đo độ đục
Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%
Albumin bò ( Bovine albumin): Dung dịch có sẵn vô trùng 0,3 g/L
Môi trường trung hòa (Na2S2O3 5 g/L, polysorbate 80 30g/L, lecithin 3 g/L)
Môi trường Lowenstein-Jensen (LJ) cho vi khuẩn Lao
3. Các bước tiến hành
3.1. Pha dung dịch chủng thử nghiệm
- Chuẩn bị chủng làm việc theo TCVN 8128-1:2009- Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường cấy trong phòng thử nghiệm và EN 12353: Hóa chất khử trùng và chất sát trùng - Bảo quản chủng vi sinh vật thử để kiểm tra hiệu lực diệt khuẩn (bao gồm cả Legionella), diệt trực khuẩn lao (mycobactericidal), diệt bào tử, diệt nấm và diệt vi rút (bao gồm cả thể thực khuẩn, bacteriophage).
- Dùng que cấy lấy 1 loop chủng từ mẫu chủng chuẩn gốc rồi cấy zic-zac lên đĩa petri chứa môi trường TSA và SDA (Candida albicans), LJ (Mycotuberculosis) sau đó để vào tủ cấy ở 37oC trong vòng 18-24h (7 ngày đối với vi khuẩn lao)
- Các chủng thử nghiệm cấy chuyển 2 lần nếu lưu ở độ âm hoặc dạng đông khô, chủng làm việc là chủng đượcc ấy chuyển lần 3, không sử dụng chủng cấy chuyển lần 4 để làm việc
- Chuẩn bị dung dịch Test suspension (N)
- Trích khuẩn lạc thuần trên đĩa thạch TSA, SDA (Candida albicans), LJ (Mycotuberculosis) đánh tan đều vào ống nghiệm chứa 10 ml dung dịch Tryptone sodium chloride solution dùng máy lắc để trộn đều dung dịch chủng thử nghiệm.
- So độ đục dung dịch đã pha với ống McFarland N để được dung dịch chủng thử nghiệm nồng độ từ 1,5 x 108 CFU/ml (dung dịch N), dung dịch để ở nhiệt độ 20oC trong vòng 2h.
- Để xác định số lượng vi khuẩn có trong dung dịch chủng thử nghiệm thì pha loãng dần bằng dung dịch Tryptone sodium chloride solution để được dung dịch có bậc pha loãng 10-7 và 108. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa thạch TSA, SDA, LJ bằng phương pháp trộn thạch hoặc phương pháp dàn thạch.
a) Phương pháp trộn thạch: hút 1ml dung dịch chủng thử nghiệm vào từng đĩa petri vô trùng (2 đĩa), rót vào mỗi đĩa 15-20ml thạch lỏng vô trùng ở nhiệt độ 45 ± 10C, xoay tròn đều, để đông thạch.
b) Phương pháp dàn thạch: hút 1ml dung dịch chủng thử nghiệm chia đều vào các đĩa thạch đông, mặt khô đã được chuẩn bị trước (ít nhất 2 đĩa), dùng que cấy dàn đều mặt thạch.
Chuẩn bị Validation suspension (NV, NVB)
Pha loãng dung dịch Test suspension (N) với Tryptone sodium chloride solution để đạt nồng độ 3,0 x 103 cfu/ml to 1,6 x 104 cfu/ml ([Khoảng 1/4 (1+3) của nồng độ 10‑5)
Chuẩn bị dung dịch kiểm soát chất trung hòa: Pha loãng dung dịch test suspension về nồng độ 3,0 x 104 cfu/ml to 1,6 x 105 cfu/ml [khoảng 1/4 (1+3) của nồng độ 10‑3)
Đếm khuẩn lạc từ dung dịch Validation suspension và validation của chất trung hòa: Phương pháp đếm tương tự như phương dung dịch test suspension, chuẩn bị dung dịch có bậc pha loãng 10-2
Đọc các đĩa sau mỗi từ 20 – 24h, ủ đến 48h
Bỏ các đĩa không đếm được vì bất cứ lý do gì
Đếm khuẩn lạc và xác định CFU. Số lượng CFU tăng lên sau mỗi thời gian đọc cần lấy số CFU lớn hơn để tính.
Ghi lại các đĩa có số lượng lớn hơn 330 CFU và xác định giá trị Vc
tính số CFU/ml từ các đĩa N, NV, NVB theo công thức
3.2. Chuẩn bị hóa chất, chế phẩm thử nghiệm
- Sản phẩm cần khảo nghiệm, test suspension, validation suspension, dung dịch pha loãng Tryptone sodium chloride solution, chất dẫn, water bath
- Nồng độ của dung dịch thử nghiệm sản phẩm phải gấp 1,25 lần nồng độ thử nghiệm mong muốn (= nồng độ thử nghiệm thực), các chế phẩm sẵn sàng sử dụng có thể thử nghiệm ở 97%
- Chế phẩm thực hiện khảo nghiệm được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất, pha bằng dung dịch nước cứng hoặc nước cất để được dung dịch hóa chất khảo nghiệm ở nồng độ yêu cầu của nhà sản xuất.
- Chế phẩm ở dạng sẵn sàng sử dụng được chuẩn bị nước cất và không khử khoáng có thể dùng nước pha tiêm
- Nếu các chế phẩm ở dạng rắn, sản phẩm được hòa tan ít nhất 1g±10mg sản phẩm với nước cứng tiêu chuẩn trong bình định mức theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Các dung dịch chế phẩm khảo nghiệm phải được chuẩn bị và sử dụng trong vòng 2 giờ, phải đảm bảo dung dịch đồng nhất, ổn định trong suốt quá trình khảo nghiệm, tránh kết tủa, đông vón.
- Trong quá trình thử nghiệm không được chạm vào các miệng ống tube
3.3. Kỹ thuật khảo nghiệm
- Đối với Chủng Pseudomonas aeruginosa; Chủng Staphylococcus aureus; Chủng E. coli ; chủng salmonella: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 13727:2012.
- Chủng Candida albicans: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 13624:2001.
- Chủng Bacillus subtilis: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 14347:2001.
- Chủng Mycotuberculosis: Kỹ thuật khảo nghiệm thực hiện theo quy trình kỹ thuật EN 14348:2005
Test Na
Cho 0,2 ml dung dịch bovin Albumin đặc gấp 5 lần vào ống nghiệm rồi cho tiếp vào 0,1 ml dung dịch đặc gấp 10 lần dung dịch test suspension chủng thử nghiệm. Bấm đồng hồ ngay lập tức, trộn đều sau đó để vào bể ủ nhiệt ở nhiệt độ (200C) trong thời gian 2 phút ± 10 giây.
Ngay sau khi kết thúc cho 9,7 ml dung dịch sản phẩm bắt bầu bấm giờ nghiệm đặt vào water bath trộng đều với nhiệt độ thử nghiệm và thời gian tiếp xúc. Trước khi kết thúc trộn lại hỗn hợp.
Hút 1,0 ml hỗn hợp này chuyển vào ống chứa 8,0 ml chất trung hòa và 1,0
ml nước, trộn và đặt vào water bath ở 20 °C ± 1 °C.
Sau 5 phút ± 10 s (thời gian tiếp xúc 10 phút hoặc ngắn hơn chỉ 10 s ± 1 s), trộn đều lấy 1ml hỗn hợp cấy ra 2 đĩa (đổ đĩa hợp ria cấy) kiểm tra
Chuyển 0,5 ml vào ống chứa 4,5 ml chất trung hòa được dung dịch pha loãng 10 lần, đặt ông này vào water bath ở 20 °C ± 1 °C trong 5 min ± 10 s (nếu thời gian tiếp xúc 10 min hoặc ngắn hơn chỉ 10 s ± 1 s). Ngay trước khi kết thúc trộn đều.
Khi kết thúc, lấy 1 ml dung dịch cấy đếm bằng phương pháp đổ đĩa hoặc ria cấy
Kiểm soát các điều kiện thử nghiệm A
- Xác nhận các điều kiện thử nghiệm đã chọn và / hoặc xác minh sự không có bất kỳ tác động ảnh hưởng đến điều kiện thử nghiệm
Lấy 0,2 ml dung dịch bovin albumin đã sử dụng ở Test Na cho vào ống nghiệm, sau đó hút 0,1 ml dung dịch đặc gấp 10 lần dung dịch validation suspension. Bấm đồng hồ ngay lập tức để trong bể ủ nhiệt với nhiệt độ (200C) trong thời gian 2 phút ± 10 giây.
Ngay sau khi kết thúc cho 9,7 ml nước bắt bầu bấm giờ nghiệm đặt vào water bath trộng đều với nhiệt độ thử nghiệm và thời gian tiếp xúc. Trước khi kết thúc trộn lại hỗn hợp.
Hút 1,0 ml hỗn hợp này chuyển vào ống chứa 8,0 ml chất trung hòa và 1,0 ml nước,trộn và đặt vào water bath ở 20 °C ± 1 °C.
Sau 5 phút ± 10 s (thời gian tiếp xúc 10 phút hoặc ngắn hơn chỉ 10 s ± 1 s), trộn đều lấy 1ml hỗn hợp cấy ra 2 đĩa (đổ đĩa hợp ria cấy) kiểm tra
Chuyển 0,5 ml vào ống chứa 4,5 ml chất trung hòa được dung dịch pha loãng 10 lần, đặt ông này vào water bath ở 20 °C ± 1 °C trong 5 min ± 10 s (nếu thời gian tiếp xúc 10 min hoặc ngắn hơn chỉ 10 s ± 1 s). Ngay trước khi kết thúc trộn đều.
Khi kết thúc, lấy 1 ml dung dịch cấy đếm bằng phương pháp đổ đĩa hoặc ria cấy
Kiểm soát chất trung hòa B
- Xác minh sự không có độc tính của chất trung hòa
Hút 9 ml dung dịch chất trung hòa vào một tube. Thêm 1 ml dung dịch Add 1,0 ml of the validation suspension (NVB) chứa 3,0 x 104 cfu/ml to 1,6 x 105 cfu/ml. Bắt đầu bấm giờ và trộn.
Chuyển 0,5 ml vào ống chứa 4,5 ml chất trung hòa được dung dịch pha loãng 10 lần, lặp lại được dung dịch pha loãng 100 lần, đặt ông này vào water bath ở 20 °C ± 1 °C trong 5 min ± 10 s (nếu thời gian tiếp xúc 10 min hoặc ngắn hơn chỉ 10 s ± 1 s). Ngay trước khi kết thúc trộn đều.
Khi kết thúc, lấy 1 ml dung dịch cấy đếm bằng phương pháp đổ đĩa hoặc ria cấy
Xác nhận phương pháp C
- Xác nhận độ pha loãng-trung hòa
Cho 0,2 ml dung dịch bovin albumin vào ống nghiệm, cho thêm 0,1 dung dịch pha loãng sau đó bấm giờ, cho thêm 9,7 ml dung dịch sản phẩm thử nghiệm đặt vào water bath trộng đều với nhiệt độ thử nghiệm và thời gian tiếp xúc. Trước khi kết thúc trộn lại hỗn hợp.
Ngay sau khi kết thúc chuyển 1,1 ml hỗn hợp vào tube chứ 8,8 ml chất trung hòa, bấm thời gian ngay khi thêm vào đặt vào water bath ở 20 °C ± 1 °C trong 5 phút ± 10 s (trong trường hợp thời gian tiếp xúc 10 phút chỉ ngắn hơn 10 s ± 1 s).
Thêm 0,1 ml dung dịch validation suspension gấp 10 lần bấm đồng hồ ngay khi thêm vào. Đặt vào water bath ở 20 °C ± 1 °C trong 30 phút ± 1 phút.
Ngay khi kết thúc trộn lại hỗn hợp
Lấy 1 ml này đổ đĩa hoặc ria cấy.
Ủ và đếm số lượng khuẩn lạc.
Ủ và đếm khuẩn lạc của dung dịch chủng thử nghiệm ban đầu và sau khi tiếp xúc hóa chất thực hiện như sau:
- Các đĩa thạch được ủ từ 20 h đến 24 h ở nhiệt độ 370C. Đối với vi khuẩn lao thì ủ từ 3-5 tuần
- Số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch là 15 - 300 khuẩn lạc (từ 15-300 khuẩn lạc đối với vi khuẩn, nấm men và 15-150 đối với nấm mốc).
- Trong cùng nồng độ vi khuẩn, số khuẩn lạc mọc trên các đĩa cho phép độ lệch 10%.
- Giữa hai nồng độ liên tiếp cho phép độ lệch là 5 đến 15 lần.
- Nếu số lượng khuẩn lạc trên đĩa < 14, thì kết quả ghi là < 14.
Nếu số lượng khuẩn lạc trên đĩa > 300, thì kết quả ghi là > 300
4. Tính toán kết quả
- Xác định giá trị Vc từ 14 – 330. Nếu nhỏ hơn 14 thì báo cáo là < 14, nếu 1 đĩa lớn hơn 330 thì báo cáo > 330, nếu có trên 1 đĩa lớn hơn 330
- Tính N, No theo công thức
- N: nồng độ vi sinh vật ở dung dịch chủng thử nghiệm ban đầu
- Na: nồng độ vi sinh vật ở dung dịch sau khi tiếp xúc dung dịch trung hòa
- N và Na được tính theo công thức: N = C/(n1 + 0,1n2)10x
Trong đó: Vc là số khuẩn lạc đếm được trên từng đĩa
C là tổng các giá trị Vc
n1 giá trị Vc ở độ pha loãng đầu tiên
n2 giá trị Vc ở độ pha loãng thứ hai
10x tương ứng hệ số pha loãng thấp nhất
- Tính Na = 10c/n
- c tổng giá trị VC
- n số lần của giá trị V c
- Tính NV, NV0 and NVB
- Nv= 10c/n, Nvb= 1000c/n
- LgR= lgN0 - lgNa
- Kết quả được ghi dưới dạng: 1,0-9,9 x 10x CFU/ml
- Lập bảng so sánh kết quả số vi sinh vật trước và sau thời gian xử lý bằng hóa chất, chế phẩm diệt khuẩn.
5. Đánh giá hiệu lực
Hiệu quả diệt khuẩn của sản phẩm đạt khi hiệu lực giảm vi khuẩn:
a) Mức độ làm sạch và khử khuẩn mức độ thấp: giảm 3 log đối với Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Escherichia coli.
b) Mức độ khử khuẩn mức độ trung bình: giảm 4 log đối với Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Escherichia coli và giảm 3 log đối với Candida albicans.
c) Mức độ khử khuẩn mức độ cao: giảm 5 log đối với Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Enterococcus hirae, Escherichia coli và giảm 4 log đối với Candida albican
d) Mức độ tiệt khuẩn: giảm 6 log đối với Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), , Escherichia coli và giảm 5 log đối với Candida albicans, và giảm 4 log đối với Bacillus subtilis.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. TCVN 8128-1:2009 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm
2. EN13727:2012: Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity in the medical area Test method and requirements
3. EN 12353: Chemical disinfectants and antiseptics - Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity
4. EN 14347:2001: Chemical disinfectants and antiseptics. Basic sporicidal activity. Test method and requirement
5. EN 13624:2013: Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of fungicidal or yeasticidal activity in the medical area - Test method and requirements
6. EN 14348:2005: Chemical disinfectants and antiseptics — Quantitative suspension test for the evaluation of mycobactericidal activity of chemical disinfectants in the medical area including instrument disinfectants —Test methods and requirements (phase 2, step 1)