I. Đặt vấn đề
Nấm da là một bệnh khá phổ biến trên người đặc biệt là khu vực có khí hậu nóng ẩm như Việt Nam. Hiện nay trên thị trường phổ biến nhiều loại thuốc điều trị nấm da sử dụng các hoạt chất như ketoconazol, clotrimazol, econazole. Tuy nhiên, việc sử dụng các loại thuốc có sẵn trên thị trường hiện nay đang dần hạn chế vì một số yếu tố bao gồm hiệu lực thấp, độ hòa tan kém, phát triển các chủng kháng thuốc, độc tính của thuốc và tác dụng phụ, như rối loạn tiêu hóa, kích ứng da, teo da, khô da, nhiễm độc gan, giảm bạch cầu.1 Do đó, các giải pháp sử dụng các thuốc trị nấm có nguồn gốc từ tự nhiên đang được quan tâm. Nhiều kinh nghiệm dân gian sử dụng các dược liệu để trị các bệnh về da như kem bôi da Thuần Mộc chứa xà sàng tử, thảo quyết minh, dầu gội đầu Thanh Mộc Hương sử dụng vỏ bưởi, bồ hòn, hà thủ ô.
Để đánh giá tác dụng diệt nấm da của các hoạt chất thiên nhiên, từ đó phát triển các sản phẩm trị nấm da cho người, cần phải có nghiên cứu đầy đủ tác dụng và độ an toàn của các sản phẩm diệt nấm. Hiện tại, nhiều mô hình đánh giá tác dụng diệt nấm in vitro, phương pháp xác định vùng kháng khuẩn, và tiền lâm sàng, mô hình động vật đã được nghiên cứu và áp dụng.2 Chuột lang (guinea pig) là loại chuột mà da của chúng có đặc điểm sinh học gần giống với da người.3,4 Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng chuột lang để nghiên cứu các thuốc trị nấm da.5,6 Tuy nhiên mô hình này còn chưa được phổ biến ở Việt Nam. Do đó, chúng tôi tiến hành xây dựng, thử nghiệm và hoàn thiện mô hình đánh giá tác dụng kháng nấm da của dược liệu trên mô hình chuột lang tại Việt Nam.
II. Quy trình thử nghiệm7,8
2.1. Lựa chọn chuột thí nghiệm và điều kiện nuôi nhốt
Chuột lang (guinea pig) trọng lượng từ 450-500 g được lựa chọn do chuột lang cũng dễ dàng bị các bệnh về nấm da và diện tích da chuột lớn, đủ để thực hiện các nghiên cứu đánh giá lâm sàng. Các quy trình thí nghiệm phải tuẩn thủ các quy định về nuôi, chăm sóc, và nhân đạo đối với động vật được pháp luật quy định. Môi trường nuôi và chăm sóc chuột phải đảm bảo nhiệt độ 16-22oC, độ ẩm từ 30-70% và duy trì quy trình 12/12 giờ sáng tối. Chuột phải được nuôi để thích nghi với môi trường tối thiểu 5 ngày trước khi thí nghiệm. Các quy trình thí nghiệm trên chuột phải được thực hiện khi chuột đã được gây mê toàn thân và phải đảm bảo giảm thiểu tối đa việc làm đau động vật nghiên cứu.
2.2. Chuẩn bị giống nấm thí nghiệm
Các chủng nấm trong thí nghiệm (Epidermophyton sp., Trichophyton sp., Microsporum sp.) có khả năng gây nhiễm tốt trên da động vật, tạo ra phản ứng viêm da và xâm lấn chân lông. Các biểu hiện lâm sàng do các chủng nấm da trong nghiên cứu đều rất điển hình. Để chuẩn bị gây nhiễm cho chuột, chúng ta tiến hành cấy các chủng nấm trên môi trường potato dextrose agar (PDA) trong đĩa pectri và tiến hành nuôi ủ ở 30oC trong vòng 5-7 ngày. Vào cuối thời kỳ sinh trưởng này, tiến hành cạo các bào tử ở trên bề mặt thạch rồi cho vào môi trường lỏng chứa nước muối sinh lý (0.85%). Dung dịch với nồng độ 1x107/100 µL bào tử nấm được sử dụng để gây nấm cho chuột.
2.3. Quy trình gây nấm trên da và đánh giá tác dụng kháng nấm của sản phẩm
Trước khi gây nhiễm nấm trên chuột lang, cần tiến hành gây mê toàn thân chuột. Phương pháp gây mê bằng tiêm bắp 0.2 mL hỗn hợp ketamine, xylazine, và acepromazine (3:3:1; v/v/v). Dùng máy cạo lông chuột để cạo vùng lông ở bên trái, cách sống lưng 2 cm. Tiến hành cạo một ô vuông kích thước khoảng 2.5 x 2.5 cm2 rồi dùng bút đánh dấu khoanh vùng da thử nghiệm lại. Dùng giấy giáp đã được vô trùng để bào mòn phần da chuột. Dùng pipet lấy 100 µL hỗn dịch chứa 1x107 bào tử bơm vào vùng da cần gây nhiễm, xoa đều để đảm bảo các bào tử nấm có thể xâm nhập vào vùng da chuột. Theo dõi trong vòng 3 ngày. Các chuột được gây nhiễm sẽ được chia vào các lô, mỗi lô 5 con gồm: lô đối chứng âm, lô đối chứng dương (chlotrimazol), lô sử dụng thuốc NLM. Quá trình thử nghiệm được tiến hành trong 7 ngày. Mỗi ngày bôi 0.2 mL thuốc thử vào vùng da bị lây nhiễm. Mẫu đối chứng âm không xử lý.
2.4. Đánh giá hiệu quả diệt nấm của dược liệu
Các động vật thử nghiệm được theo dõi hàng ngày. Thời điểm kết thúc đánh giá hiệu quả lâm sàng và đặc tính của nấm là 13 ngày tính từ ngày gây nấm cho chuột. Hiệu quả lâm sàng được đánh giá trước sau đó các mẫu lông chuột được dùng để đánh giá đặc tính kháng nấm.
2.4.1. Đánh giá hiệu quả lâm sàng
Khu vực da chuột thử nghiệm được chia thành 4 phần. Đánh giá hiệu quả lâm sàng đối với vùng da nhiễm nấm được thực hiện trên từng phần bằng phương pháp cho điểm với thang điểm từ 0-5. Trong đó, 0 là không có vùng tổn thương; 1 là có một số vùng bị ban đỏ nhẹ, 2 là có một số vùng bị đỏ và sưng tấy; 3 là khu vực ban đỏ rộng, có lớp vẩy, bong tróc, mảng hói, loét; 4 là một phần da bị phân hủy/tổn thương và rụng lông; 5 là da bị tổn thương nghiêm trọng và rụng hoàn toàn lông. Điểm của các phần được tổng hợp và được dùng để đánh giá hiệu quả thử nghiệm lâm sàng. Hiệu quả kháng nấm trên lâm sàng được đánh giá là tỷ lệ phần trăm so với mẫu đỗi chứng.
Hiệu quả thử nghiệm lâm sàng = 100-[T x (100/K)]
Trong đó: T là tổng điểm lâm sàng của nhóm thử nghiệm
K là tổng điểm của nhóm đối chứng âm
2.4.2. Đánh giá hiệu quả trị nấm
Thử nghiệm xâm lấn chân lông được dùng để đánh giá tỷ lệ điều trị nấm trong nghiên cứu. Lông chuột ở vùng thử nghiệm được lấy bằng dụng cụ vô trùng. 10 sợi lông/phần da nhiễm nấm được lấy và cấy trên môi trường PDA và được nuôi ủ ở 30oC trong 2-4 ngày. Sau quá trình nuôi ủ, tiến hành soi bào tử nấm ở các chân lông bằng kính hiển vi. Số lượng chân lông bị nhiễm nấm ở các phần trên vùng da thử nghiệm được tổng hợp. Hiệu quả của thuốc trong việc giảm số lượng lông bị nhiễm nấm trong các thử nghiệm được tính bằng tỷ lệ phần trăm so với mẫu đối chứng sử dụng công thức sau:
Hiệu quả kháng nấm = 100-[T x (100/K)]
Trong đó: T là tổng số lông bị nhiễm nấm trong mẫu thử nghiệm
K là tổng số lông bị nhiễm nấm trong mẫu đối chứng âm
Tài liệu tham khảo
1. Garg, A. et al. Recent advances in topical carriers of anti-fungal agents. Heliyon6, e04663 (2020).
2. Mikaeili, A. et al. Antifungal activities of Astragalus verus Olivier. Against Trichophyton verrucosum on in vitro and in vivo guinea pig model of dermatophytosis. Mycoses 55, 318–325 (2012).
3. Saunte, D. M. et al. Experimental guinea pig model of dermatophytosis: A simple and useful tool for the evaluation of new diagnostics and antifungals. Med. Mycol. 46, 303–313 (2008).
4. Song, X., Wei, Y. X., Lai, K. M., He, Z. D. & Zhang, H. J. In vivo antifungal activity of dipyrithione against Trichophyton rubrum on guinea pig dermatophytosis models. Biomed. Pharmacother. 108, 558–564 (2018).
5. Shimamura, T., Kubota, N. & Shibuya, K. Animal model of dermatophytosis. J. Biomed. Biotechnol. 2012, (2012).
6. Baumbach, C. M. et al. Modeling dermatophytosis: Guinea pig skin explants represent a highly suitable model to study Trichophyton benhamiae infections. J. Dermatol. 47, 8–16 (2020).
7. Long, L., Hager, C. & Ghannoum, M. Evaluation of the efficacy of ME1111 in the topical treatment of dermatophytosis in a Guinea pig model. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 2343–2345 (2016).
8. Ghannoum, M. A. et al. Efficacy of terbinafine compared to lanoconazole and luliconazole in the topical treatment of dermatophytosis in a guinea pig model. Med. Mycol. 48, 491–497 (2010).