Phương pháp định lượng Clostridium perfringens có khả năng mọc trên đĩa thạch. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
Các sản phẩm dùng cho con người và thức ăn cho động vật, và
Các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
Phương pháp này bao gồm các bước sau:
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử phải được lấy theo tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng.
Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự thoả thuận với nhau về vấn đề này.
Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.
Chuẩn bị dung dịch pha loãng:
Pha loãng mẫu thử theo TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).
Cấy và ủ:
Cấy 1 ml mẫu thử hoặc 1 ml huyền phù ban đầu vào mỗi đĩa Petri trống.
Rót 10 ml đến 15 ml thạch SC vào mỗi đĩa, trộn đều chất cấy và để đông đặc.
Phủ kín thêm một lớp dày 10 ml thạch SC.
Ủ các đĩa trong điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 20 giờ ± 2 giờ.
Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa.
Khẳng định sinh hoá:
Chọn năm khuẩn lạc điển hình và khẳng định chúng sử dụng một trong hai kỹ thuật mô tả trong 9.4.2 và 9.4.3.
Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS:
Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường thioglycollat lỏng.
Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 18 giờ đến 24 giờ.
Chuyển 5 giọt dịch cấy vào môi trường LS.
Ủ trong điều kiện hiếu khí ở 46 °C trong 18 giờ đến 24 giờ.
Kiểm tra các ống nghiệm đựng môi trường LS về việc sinh khí và có xuất hiện màu đen.
Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch SC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C.perfringens.
Kỹ thuật sử dụng môi trường nitrat để thử tính di động và môi trường lactoza-gelatin:
Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc vào môi trường nitrat để thử tính di động mới khử khí.
Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 24 giờ.
Kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách dùng thuốc thử phát hiện nitrit.
Sự hình thành màu đỏ khẳng định sự khử nitrat về nitrit.
Cấy khuẩn lạc vào môi trường lactoza-gelatin.
Ủ trong điều kiện hiếu khí ở 37 °C trong 24 giờ.
Kiểm tra sự có mặt của khí và sự phân hủy gelatin.
Vi khuẩn có khả năng di động, khử nitrat về nitrit, tạo khí và phân hủy gelatin được coi là C.perfringens.