Nguyễn Hữu Nghị, Trần Thị Oanh, Trần Thị Lan
Viện Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thiên nhiên
176 Phùng Khoang, Trung Văn, Nam Từ Liêm, Hà Nội
Summary
Areca catechu nut and Piper betle leaf are represented for Vietnamese culture and used in traditional medicine. Owing to high bioactive compounds such as polyphenols, alkanoids, steroids, essential oils, Areca catechu nut and Piper betle leaf have been reported with significant antibacterial activities. In the present research, antibacterial activity of a mouthwash RUMIE has been investigated. With Areca catechu nut and Piper betle leaf extract, RUMIE show significant antibacterial activity against a oral cavity bacteria Streptococcus mutans, which is compatible with chlohexidine gluconate 0,12%. The minimum inhibitory concentration and minimun bactericial concentration of Areca catechu nut and Piper betle leaf extract in RUMIE were 0,1/0,2%, respectively. The present results are of importance for proving the antibacterial properties of RUMIE in particular and of Areca catechu nut and Piper betle leaf, in general.
Key words: Areca catechu nut, Piper betle leaf, RUMIE mouthwash, S. mutans
Tóm tắt
Quả cau, lá trầu là hình ảnh gắn liền với văn hóa của nước ta và được sử dụng trong y học cổ truyền. Nhờ có nhiều hoạt chất thiên nhiên như polyphenol, alkanoid, steroid, tinh dầu mà cau và trầu đã được chứng minh tác dụng kháng khuẩn của chúng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá khả năng kháng khuẩn gây bệnh răng miệng của nước súc miệng RUMIE trên chủng vi khuẩn gây bệnh về răng miệng Streptococcus mutans. Kết quả cho thấy, nước súc miệng RUMIE có khả năng kháng khuẩn S. mutans tương đương với chlohexidine gluconate ở nồng độ 0,12%. Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao chiết cau/trầu trong nước súc miệng RUMIE là 0,1/0,2%. Kết quả này là thông tin quan trọng khẳng định tác dụng diệt khuẩn đường răng miệng của RUMIE cũng như của quả cau và lá trầu Việt Nam.
Từ khóa: Quả cau, lá trầu, nước súc miệng RUMIE, S. mutans
1. Đặt vấn đề
Sâu răng là một trong những bệnh về răng miệng phổ biến nhất hiện nay. Theo số liệu của Hội Răng Hàm mặt thì hiện nay có khoảng 90% dân số Việt Nam đang gặp phải những vấn đề về răng miệng, trong đó có bệnh sâu răng, viêm lợi là phổ biến nhất.1 Nguyên nhân của các bệnh liên quan đến răng miệng chủ yếu do các vi sinh vật trong khoang miệng gây ra. Trong đó Streptococcus mutans là loại điển hình, phổ biến nhất được tìm thấy ở các bệnh nhân sâu răng và viêm xoang miệng.2 Ngoài các vi khuẩn thuộc chi Streptococcus như S. mutans, S. sobrinus, chi Lactobacillus, Actinomyces cũng là tác nhân gây ra các bệnh về răng miệng.3,4 Các vi khuẩn này tồn tại trên mảng bám răng và có khẳ năng sinh acid và tạo màng biofilm do khả năng sinh ra các polysacharide ngoại bào.5,6 Ngoài ra, các vi khuẩn trong khoang miệng còn có khả năng lên men thức ăn tạo ra các sản phẩm dễ bay hơi có mùi khó chịu gây ra hiện tượng hôi miệng cũng như làm thay đổi acid của khoang miệng gây ra hiện tượng khử khoáng, làm ảnh hưởng đến độ bền của răng và các tổ chức xung quanh răng.
Để phòng chống sâu răng và các bệnh liên quan đến răng miệng, người ta sử dụng các chất kháng khuẩn trong các sản phẩm sử dụng vệ sinh răng miệng hàng ngày như kem đánh răng, nước súc miệng. Các sản phẩm này thường chứa các thành phần như flour, chất kháng sinh, muối kim loại.1 Việc sử dụng các chất kháng sinh có thể làm thay đổi hệ vi sinh vật trong miệng cũng như trong hệ tiêu hóa ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh.7 Sử dụng fluor nhiều trong thời gian dài có thể gây ra một triệu chứng như răng đổi màu, và có thể gây ra hiện tượng xương nhiễm flour ảnh hưởng đến cấu trúc xương và khớp.1 Điều đó đặt ra cho các nhà khoa học phải nghiên cứu và tìm ra các giải pháp an toàn hơn cho vấn đề xử lý vi sinh vật gây hại trong khoang miệng. Việc sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên trong điều trị các bệnh về răng miệng đã được nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến.8 Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất polyphenol như quercetin, kaepferol, mangostin có tác dụng diệt các loại vi khuẩn gây bệnh răng miệng.6,7,9
Quả cau và lá trầu không là hai hình ảnh gắn liền với nhiều văn hóa và thói quen của người dân Việt Nam. Từ xa xưa, người dân, đặc biệt là phụ nữ Việt Nam có thói quen ăn trầu cau cho môi đỏ, răng đen. Ngoài ra, việc ăn trầu còn được ghi nhận là giúp tránh sâu răng. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã xác định thành phần hóa học trong quả cau và lá trầu trong đó chủ yếu là các flavonoid, tannin, steroid, saponin, alkanoid, tinh dầu.10,11 Các hoạt chất này đã được chứng minh có khả năng diệt khuẩn phổ rộng trong đó có các vi khuẩn gây bệnh với răng miệng. Chiết xuất bằng Ethanol của quả cau có khẳ năng ức chế một số vi khuẩn như S. aureus, E. coli, C. albicans và B. subtilis.11 Polyphenol trong hạt cau được chứng minh có khả năng ức chế vi khuẩn gây sâu răng S. mutans.12 Dịch chiết của lá trầu cũng có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn S. mutans với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 0,25%.13 Từ những kết quả trên, để đánh giá khả năng ứng dụng quả cau, lá trầu trong việc ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường răng miệng, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn của nước súc miệng RUMIE, được sản xuất từ chất chiết quả cau, lá trầu Việt Nam.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn S. mutans được phân lập từ các bệnh nhân tình nguyện
Môi trường nuôi cấy tryptone yeast extrac agar (TYG) chứa 3% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men và 1% glucose, 15% agar
Cau và trầu được thu hái tại Hát Môn, Phúc Thọ, Hà Nội
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu quả cau, lá trầu
Lấy 100 g hạt cau tươi, nghiền nhỏ sau đó thêm 500 mL EtOH 50% vào ngâm trong 24h sau đó rút dịch chiết. Tiếp tục thêm 350 mL EtOH 50% vào và ngâm trong 24h ở nhiệt độ phòng. Gộp dịch của hai lần chiết và cô đến 200 mL cảo lỏng. Cao lỏng sẽ được sử dụng để bào chế nước súc miệng RUMIE.
Lấy 100 g lá trầu, cắt nhỏ rồi thêm 500 mL nước RO. Gia nhiệt ở 90oC trong vòng 3h thu được dịch chiết lần 1. Tiếp tục chiết lần 2 và lần 3 với lượng nước lần lượt là 3,5 L và 3 L. Gộp toàn bộ dịch chiết và cô trong thiết bị cô chân không đến 200 mL cao lỏng. Cao lỏng lá trầu sẽ được sử dụng để bào chế nước súc miệng RUMIE
2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn trên chủng S. mutans
Khả năng kháng khuẩn của nước súc miệng RUMIE trên chủng S. mutans được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.11 Cấy 100 µL dung dịch vi khuẩn thử nghiệm vào đĩa thạch TYG đường kính 110 mm, tiến hành trang đều vi khuẩn lên bề mặt đĩa thạch. Sử dụng dụng cụ vô trùng khi đục lỗ trên đĩa pectri có chứa môi trường thạch. Lấy 100 µL nước súc miệng RUMIE nhỏ vào giếng, dung dịch chlohexidine gluconate 0,12% được sử dụng làm đối chứng dương và nước cất vô trùng làm đối chứng âm. Sau khi nuôi ủ ở 37oC trong vòng 24 h, tiến hành đo đường kính vòng tròn vô khuẩn (đường kính vòng tròn vô khuẩn trừ đi đường kính lỗ đục). Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu được thực hiên theo Rahman và cs. 2014.14 Cao cau/trầu (1/2) ở nồng độ (%): 0,05/0,1; 0,1/0,2; 0,2/0,4; 0,4/0,8 được pha vào nền nước súc miệng để đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nước súc miệng RUMIE. Lấy 2 mL dung dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm. Sau đó cho cùng một lượng nước súc miệng RUMIE vào ống nghiệm đã có vi khuẩn và nuôi ủ ở 37oC trong 24h. Sau đó quan sát ở các ống nghiệm. Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ tại đó không quan sát thấy vi sinh vật trong ống nghiệm. Để xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, lấy 0,1 mL hỗn hợp dung dịch vi khuẩn và nước súc miệng sau khi nuôi cấy 24h chuyển vào đĩa thạch TYG, láng đều dung dịch trên bề mặt đĩa thạch và tiến hành nuôi ủ ở 37oC trong 24h. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là nồng độ mà tại đó không quan sát thấy vi sinh vật trên đĩa thạch sau thời gian nuôi ủ.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS. ANOVA được sử dụng để so sánh sự khác biệt ở mức ý nghĩa P<0,05.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Khả năng kháng vi khuẩn S. mutans của nước súc miệng RUMIE
Tác dụng kháng khuẩn của nước súc miệng RUMIE đối với vi khuẩn gây bệnh răng miệng S. mutans được thể hiện ở hình 1. Đường kính vòng tròn vô khuẩn đối của nước súc miệng RUMIE là 11,7 mm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với dung dịch chlohexidine gluconate (11,9 mm). Trong khi mẫu đối chứng âm sử dụng nước cất không có tác dụng ức chế vi khuẩn S. mutans. Điều này cho thấy, nước súc miệng RUMIE có tác dụng kháng khuẩn với vi khuẩn gây sâu răng S. mutans tương đương với hóa chất diệt khuẩn chlohexidine gluconate ở nồng độ 0,12%. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong thành phần dịch chiết của quả cau và lá trầu chứa nhiều hợp chất flavonoid, tannin, alkanoid, saponin, các steroid và tinh dầu.11,15 Các hợp chất này được chứng minh khả năng diệt khuẩn trên phổ rộng với nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nói chung và các vi khuẩn gây bệnh răng miệng nói riêng.14,16
3.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của nước súc miệng RUMIE
Kết quả xác định MIC và MBC của nước súc miệng RUMIE được thể hiện ở bảng 1. Kết quả cho thấy ở công thức nước súc miệng với 0,1% dịch chiết hạt cau và 0,2% dịch chiết lá trầu không phát hiện sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn S. mutans trong ống nghiệm và trên đĩa thạch sau khi nuôi ủ trong 24h. Ở nồng độ 0,05/0,1%, khuẩn lạc của S. mutans vẫn được tìm thấy trong ống nghiệm và trên đĩa thạch. Do đó dung dịch nước súc miệng với 0,1% cao hạt cau và 0,2% cao lá trầu là nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu để sử dụng khi bào chế nước súc miệng.
4. Kết luận
Quả cau và lá trầu là hai sản phẩm thiên nhiên được trồng và sử dụng phổ biến ở Việt Nam trong văn hóa và trong y học. Do trong thành phần có nhiều các hợp chất như polyphenol, saponin, tinh dầu mà quả cau và lá trầu được nghiên cứu và chứng minh khả năng kháng khuẩn của hai sản phẩm này. Nước súc miệng RUMIE được bào chế từ hai thành phần chính là cao chiết quả cau và lá trầu. Tác dụng kháng khuẩn của RUMIE được chứng minh qua tác dụng kháng vi khuẩn gây bệnh răng miệng S. mutans với MIC và MBC của cao chiết cau/trầu là 0,1/0,2%. Kết quả nghiên cứu là thông tin quan trọng để khẳng định tác dụng sát khuẩn răng miệng của RUMIE nói riêng và quả cau lá trầu Việt Nam nói chung góp phần phát triển các sản phẩm từ hai dược liệu thiên nhiên này.
Tài liệu tham khảo
1. Đức, H. H., Việt, C. V., Vũ, A. N. & Mai, P. N. T. Đánh giá tác dụng kháng sâu răng của nước súc miệng chứa alpha mangostin. Thông tin khoa học công nghệ 3, 163–169 (2017).
2. Lạt, L. H., Vương, L. D., Thị, P. & Trang, P. Phân lập Streptococcus mutans gây sâu răng và khảo sát sự ức chế vi khuẩn này bởi một số dược liệu dân gian. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ 2, 31–37 (2018).
3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I. & Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721–5732 (2005).
4. Yadav, K. & Prakash, S. Dental Caries: A Microbiological Approach. J. Clin. Infect. Dis. Pract. 02, 1–15 (2017).
5. Bowden, G. H. W. The microbial ecology of dental caries. Microb. Ecol. Health Dis.12, 138–148 (2000).
6. Phương, M., Hoài, V., Lương, T. & Phươ, H. Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu răng strptococcus mutans UA159. Tạp chí sinh học35, 100–105 (2013).
7. Jensen, D. M. Activity of quercetin and kaemferol against Streptococcus mutans biofilm. Arch. Oral Biol. 98, 9–16 (2019).
8. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L. & Koo, H. Natural products in caries research: Current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Res. 45, 243–263 (2011).
9. Li, J., Wu, T., Peng, W. & Zhu, Y. Effects of resveratrol on cariogenic virulence properties of Streptococcus mutans. BMC Microbiol. 20, 1–11 (2020).
10. Chauhan, E. S., Aishwarya, J., Singh, A. & Tiwari, A. A Review: Nutraceuticals Properties of Piper betel (Paan). Am. J. Phytomedicine Clin. Ther. 4, 028–041 (2016).
11. Pahadia, A., Gawde, R. & Agrawal, S. Antimicrobial activity of hydro alcoholic extract of Areca catechu. Int. J. Pharm. Erud. 3, 18–25 (2013).
12. Sarpangala, K. B., Sarpangala, M. & Devasya, A. Antimicrobial Properties of Areca Nut, Areca Catechu, L: a Review. Int. J. Res. Ayurveda Pharm. 8, 8–12 (2017).
13. Mohammad Subri, L., Dewi, W. & Satari, M. H. The antimicrobial effect of piper betel leaves extract against Streptococcus mutans. Padjadjaran J. Dent. 24, 174–178 (2012).
14. Rahman, M. A. et al. Comparative Antimicrobial Activity of Areca catechu Nut Extracts using Different Extracting Solvents. Bangladesh J. Microbiol. 31, 19–23 (2016).
15. Budiman, A., Rusnawan, D. W. & Yuliana, A. Antibacterial activity of piper betle L. Extract in cream dosage forms against Staphylococcus aureus and propionibacterium acne. J. Pharm. Sci. Res. 10, 493–496 (2018).
16. Chin, A. A. et al. Antimicrobial performance of ethanolic extract of areca catechu L seeds against mixed-oral flora from tooth scum and gram negative laboratory isolates. Int. J. Res. Ayurveda Pharm. 4, 876–880 (2013).